Privilégié par Louis XII comme résidence d'hiver, le château de Blois devient le théâtre de plusieurs rencontres diplomatiques : mariage de César Borgia en 1499 ; réception de Philippe le Beau en 1501 ; noces de Guillaume IX, marquis de Montferrat et d'Anne d'Alençon, fille du duc René d'Alençon, en 1508 ; fiançailles de Marguerite d'Angoulême avec le duc Charles IV d'Alençon en 1509 ; séjours de Nicolas Machiavel en 1501 et 1510. Anne de Bretagne meurt au château le 9 janvier 1514. Ses funérailles sont célébrées à la collégiale Saint-Sauveur de Blois, près du château.

Claude de France, fille de Louis XII et d'Anne de Bretagne, épouse en 1514 son cousin François d'Angoulême, arrière-petit-fils de Louis d'Orléans. Il monte sur le trône en 1515 et Claude de France, avec l'intention de quitter le château d'Amboise, meuble alors le château de Blois pour y installer la Cour. Cette même année, François Ier lance la construction d'une nouvelle aile, de style Renaissance, et y commence une des plus importantes collections de livres de l'époque. La direction des travaux est donnée à l'architecte italien Dominique de Cortone à qui l'on doit l'escalier monumental. Mais après la mort de sa femme au château, en 1524, la construction s'arrête ; François Ier délaisse le château de Blois au profit du château de Fontainebleau où il envoie l'impressionnante bibliothèque pour fonder la Bibliothèque nationale. Néanmoins, Blois n'est pas délaissée pour autant puisque Claude de France y avait mis au monde sept enfants, Blois devenant ainsi une sorte de « pouponnière » royale où sont éduqués les enfants royaux jusqu'à Catherine de Médicis. Le 18 octobre 1534, le château est le théâtre de l'affaire des Placards : des tracts contre la messe sont affichés clandestinement par des partisans de l'église réformée, jusque sur la porte de la chambre du roi. Cette affaire marque le début de la répression du protestantisme en France, après une période de relative tolérance.